آزمایشگاه شیر

آزمایشگاه شیر
تستها و امور روتینی عملیات آزمایشگاه شیر

روشهای آزمون
- تعیین وزن مخصوص                                          – تعیین دانسیته شیر
- تعیین ماده خشک بدون چربی                                 – تعیین اسیدیته
- تعیین فسفاتاز                                                    – شمارش کلی فرم ها
- اشرشیاکلی                                                        – تعیین شمارش کل باکتریها

تعیین ماده خشک [1]
این روش فقط در مورد شیر معمولی و تازه قابل اجرا می باشد.

روش آزمون
مقدار معینی از نمونه شیر را تا بدست آوردن وزن ثابت بوسیله حرارت خشک کنید. وزنی که پس از خشک کردن شیر بدست می آید، ماده خشک شیر می باشد.

روش کار
آماده کردن نمونه
قبل از شروع آزمون درجه حرارت نمونه را به 2±20 درجه سانتیگراد برسانید و بدقت هم بزنید. چنانچه چربی کاملا در تمام نمونه خوب پخش و یکنواخت نگردد، نمونه را به ملایمت تا ºC۴٠ حرارت داده، هم بزنید و مجددا تا حرارت 2±20 درجه سانتیگراد سرد کنید.

اندازه گیری
- کپسول و سرپوش آنرا به مدت ٣٠ دقیقه در حرارت 2±20 درجه سانتیگراد خشک کنید.
- کپسول و سرپوش را در دسیکاتور قرار دهید و پس از سرد شدن تا حرارت محیط، آنرا وزن کنید.
- حدودml ۳ از شیر مورد آزمایش را در کپسول بریزید و سرپوش کپسول را گذاشته و آنرا وزن کنید.
- سپس کپسول بدون سرپوش را به مدت ٣٠ دقیقه در بن ماری جوشان قرار دهید.
- کپسول و سرپوش را به مدت ۲ ساعت در اتو 2±20 درجه سانتیگراد قرار دهید. سرپوش باید در کنار کپسول گذاشته شود.
- کپسول را در دسیکاتور سرد کنید تا اختلاف بین دو توزین از mg۵/٠ تجاوز نکند.

بیان نتیجه
وزن پس از خشک کردنx۱٠٠/ وزن قبل از خشک کردن = نسبت درصد ماده خشک

نکته
اشتباه بین دو بار آزمون متوالی نباید از ٠۵/٠ درصد ماده خشک تجاوز کند.

اندازه گیری چربی
۱٠ سی سی اسید سولفوریک ژربر (٩ تا اسید، ۱ سی سی آب مقطر) داخل بوتریمتر می ریزیم، سپس ۱۱ سی سی شیر را با پیپت به آرامی به آن اضافه می کنیم و یک سی سی الکل آمیلیک به آن اضافه می کنیم. بوتریمتر را با آب مقطر تنظیم می کنیم. درب بوتریمتر را می بندیم، سپس بوتریمتر را با چند بار بالا و پایین آوردن یکنواخت می کنیم و سپس در داخل سانتریفوژ با دور rpm۱۲٠٠ به مدت ۵ دقیقه قرار می دهیم، سپس چربی را می خوانیم.

1-2-3. روش اندازه گیری دانسیته شیر
دستگاه مورد استفاده برای انجام این آزمایش، ترمولاکتودانسیمتر نام دارد. ترمولاکتودانسیمتر دارای مدلهای مختلفی است که مهمترین آنها عبارتند از مدل ژربر.
لاکتودانسیمتر ژربر از یک بدنه استوانه ای، یک ستون مدرج و یک گرماسنج تشکیل یافته است. در انتهای تحتانی بدنه یک آمپول کروفی پر از دانه های مس یا جیوه قرار دارد که باعث نگه داشتن لاکتودانسیمتر در داخل شیر می گردد. ستون مدرج در انواع مختلف لاکتودانسیمتر از 40-20 یا 36-25 درجه بندی شده است که معادل وزن مخصوص 1040-1020 در ºC۱۵ می باشد.

روش کار
آماده کردن نمونه
اگر شیر مورد آزمایش قبلا سرد شده باشد و خامه آن جدا شده باشد، ابتدا آن را در بن ماری ºC40-35 گرم نموده و شیر را کاملا یکنواخت می نماییم. سپس نمونه را تا دمای ºC20-15 با آب سرد سریعا خنک نموده، تا حباب های گاز موجود در آن خارج گردد. سپس به آهستگی بطوریکه از ایجاد کف جلوگیری شود، آنرا به داخل پیمانه استوانه ای خشک و تمیز بریزید تا ٣⁄۲ استوانه از شیر پر شود. بعد لاکتودانسیمتر را که قبلا با نمونه شیر خیس کرده اید وارد شیر نموده و آنرا رها نمایید و مجددا آنقدر شیر داخل پیمانه استوانه ای بریزید تا سطح شیر به دهانه برسد و حتی از آن لبریز گردد. 3-2 دقیقه صبر کنید تا ترمولاکتودانسیمتر از حرکت بایستد. سپس دما را روی دماسنج خوانده و روی ستون مدرج درجه ای را که هم تراز شیر است یادداشت نمایید.

محاسبه
وقتی دمای شیر ºC۱۵ باشد، رقمی که روی ستون مدرج لاکتودانسیمتر خوانده می شود وزن مخصوص شیر را نشان می دهد. اگر دمای شیر بیشتر یا کمتر از ºC۱۵ باشد، باید نتیجه را اصلاح نمود. بدین ترتیب که بین ۱۵ و ºC۲٠ در ازای هر یک درجه دمای شیر بیشتر یا کمتر از ºC۱۵ باشد، ۲/٠اضافه یا کسر می نماید، چون هر قدر دمای شیر بیشتر از ºC۱۵ باشد، دانسیته کمتر خواهد بود.
روش تعیین اسيديته کل و pH  یا تراکم یونهای H  در برخی از فرآورده های لبنی
تعیین اسیدیته در شیر، خامه، انواع بستنی، ماست و دوغ
آماده کردن نمونه
نمونه را به آرامی تکان داده و یا هم بزنید، اگر نمونه یکنواخت نباشد و یا یخ زده باشد، آنرا تا ۱ ± ٣٧ درجه سانتیگراد در داخل بن ماری مجهز به ترموستات قابل کنترل، گرم نمایید. انواع بستنی را ابتدا تا دمای اتاق گرم نمایید تا نرم شود.

روش کار
مقدار g18-9 از نمونه را در بشر ۱٠٠ میلی لیتری وزن نمایید. هم وزن نمونه به آن آب مقطر عاری از انیدرید کربنیک بیافزایید. مقدار ml۵/٠ معرف فنل فتالئین به آن افزوده و با هیدروکسید سدیم N۱/٠ عیارسنجی نمایید. این عمل را تا ظهور رنگ صورتی کمرنگی که حداقل به مدت ٣٠ ثانیه پایدار بماند، ادامه دهید.

محاسبه
اسیدیته بر حسب درصد اسید لاکتیک بیان می شود. g٠٠٩/٠ اسید لاکتیک معادل یک میلی لیتر سود N۱/٠ مصرف شده می باشد.
= درصد اسیدیتهN x٠٠٩/٠  x ۱٠٠ / M

که در آن :
N = مقدار میلی لیتر سود N۱/٠ مصرف شده ؛
M= وزن نمونه ؛
و یا

20/N = درصد اسیدیته (وقتی مقدار نمونه g۱۸ باشد)

و یا

10/N = درصد اسیدیته (وقتی مقدار نمونه g٩ باشد)

تعیین اسیدیته در شیر خشک کامل و بدون چربی
روش کار
g10 پودر شیر خشک بدون چربی، شیر شکلات یا g۱٣ شیر خشک کامل را در یک بشر ۲۵٠ میلی لیتری وزن نمایید. مقدار ml۱٠٠ آب مقطر عاری از انیدرید کربنیک به آن افزوده و به وسیله همزن، آنرا حداقل به مدت یک دقیقه مخلوط کنید (توجه داشته باشید تا کف زیادی در آن تشکیل نشود). نمونه را به مدت یک ساعت به همین حالت نگهدارید و در دمای محیط قرار دهید. سپس با یک همزن به آهستگی آنرا هم زده، آنگاه مقدار ml۶/۱٧ از نمونه را بوسیله پیپت به یک ارلن مایر یا کپسول چینی انتقال دهید. پیپت را بوسیله همان حجم آب مقطر شستشو نموده و به نمونه اضافه نمایید. مقدار ml۵/٠ معرف فنل فتالئین به نمونه افزوده با هیدروکسید سدیم N۱/٠ عیارسنجی نمایید. این عمل را تا ظهور رنگ صورتی که به مدت ٣٠ ثانیه پایدار بماند، ادامه دهید.

محاسبه
اسیدیته بر حسب درصد اسید لاکتیک بیان می شود :
= درصد اسیدیتهN x٠٠٩/٠  x ۱٠٠/M
که در آن :
N = مقدار میلی لیتر سود N۱/٠ مصرف شده
M= وزن نمونه
و یا

20/N = درصد اسیدیته

تعیین اسیدیته در پودر سرم، پودر دوغ کره
روش کار
به دقت g۵/۶ پودر سرم و یا g۵/٧ پودر دوغ کره را داخل یک بشر ۱٠٠ میلی لیتری وزن نمایید. ml۲۵٠ آب مقطر عاری از انیدرید کربنیک به آن افزوده و بوسیله یک همزن شیشه ای به آهستگی آن را هم بزنید، تا ذرات آن به حالت تعلیق در آیند. محتوی بشر را به یک ارلن مایر ۱٠٠ میلی لیتری انتقال داده، بوسیله پیپت با آب مقطر داخل بشر را شستشو داده و به نمونه بیافزایید و بالاخره حجم نمونه را با آب مقطر به ml۱٠٠ برسانید. مقدار ml۶/۱٧ از نمونه آماده شده را بوسیله پیپت و به یک ارلن مایر انتقال دهید، پیپت را با همان هم حجم نمونه آب مقطر شستشو داده و به آن بیافزایید.
سپس مقدار ml۵/٠ معرف فنل فتالئین به آن افزوده و بوسیله هیدروکسید سدیم N۱/٠ عیارسنجی نمایید. این عمل را تا ظهور رنگ صورتی که به مدت ٣٠ ثانیه پایدار بماند، ادامه دهید.

محاسبه
درصد اسیدیته بر پایه نمونه بازسازی شده در پودر سرم و پودر دوغ کره از فرمول زیر بدست می آید :
= درصد اسیدیتهN x٠٠٩/٠  x ۱٠٠/M
که در آن :
N = مقدار میلی لیتر سود N۱/٠ مصرف شده ؛
M= وزن نمونه

نکته
مقدار آب مقطری که به منظور حل کردن نمونه مورد استفاده قرار می گیرد، بسته به نوع فرآورده، دارای حجم متفاوت است، بطوریکه در زیر برای هر فرآورده به تفکیک شرح داده می شود :
- در شیر کامل، شیر پس چرخ و دوغ، شیر شکلات، شیرهای غلیظ و تبخیر شده ماست و انواع بستنی نمونه با دو برابر آب مقطر رقیق می گردد.
- در سرم شیر نمونه با یک برابر آب مقطر رقیق می شود.

تعیین pH
تنظیم pH متر
- pH متر باید حداقل ٣٠ دقیقه قبل از انجام آزمایش روشن گردد.
- pH متر را قبل از استفاده باید بوسیله محلول بافر تنظیم کرد. برای این منظور از حدود ml۲۵ محلول بافر در یک بشر ۵٠ میلی لیتری استفاده می شود.
- pH بافر باید حتی الامکان به pH نمونه مورد آزمایش نزدیک باشد. اگر pH نمونه با pH بافر تفاوت زیاد داشته باشد، باید از دو بافر با استاندارد ۴pH= و ٧pH= برای تنظیم pH متر استفاده نمود و سپس تنظیم را مطابق دستور سازنده دستگاه ادامه داد.

روش سنجش pH پنیرهای نرم
- الکترود توأم را مستقیما در پنیر فرو ببرید، بطوریکه قسمت حساس pH متر با نمونه کاملا پوشیده شود.
- دمای نمونه را مشخص کرده و درجه دستگاه را روی دمای نمونه قرار دهید. بهتر است دمای نمونه حدود 3±25 درجه سانتیگراد باشد و نمونه حداقل به مدت ۴۵ ثانیه باید با الکترود در تماس باقی بماند.
- دستگاه را به کار انداخته و مستقیما pH را بخوانید.

نکته
۱- برای اطمینان از تنظیم pH متر از بافر تازه تهیه شده استفاده نمایید. محلول بافر را برای جلوگیری از تبخیر و آلودگیهای میکروبی در شیشه هایی که در آنها کاملا بسته می شود نگهداری نمایید. هرگز بافر استفاده شده را مجددا داخل شیشه ذخیره آن بر نگردانید (در انتهای کار آنرا دور بریزید).
۲- اگر نوع نمونه پنیر عوض شود و یا فاصله اندازه گیری از ٣٠ دقیقه تجاوز کند، بهتر است که pH متر دوباره تنظیم شود.

روش سنجش pH پنیرهای سخت
برای پنیرهایی که ترد و شکننده هستند، یا پنیرهای سخت که امکان فرو کردن الکترود در نمونه وجود ندارد، باید حداقل g۵٠ از نمونه را برداشته، به شرح زیر عمل نمایید :

خرد کردن نمونه
خرد کردن نمونه باید سریع انجام گیرد تا پنیر خشک نشود. قطعات جدا شده از پنیر را با یکی از روشهای زیر خرد کنید.
یا در مخلوط کن بسته ریخته و پس از بستن دهانه آن نمونه را خرد کنید. در صورت عدم دسترسی به مخلوط کن از یک آسیاب استفاده نمایید. پس از اینکه نمونه کاملا همگن شد، بلافاصله از آن جهت آزمایش استفاده نمایید. در صورتیکه نتوان بلافاصله با انجام آزمایش اقدام نمود، نمونه را در یک ظرف کاملا بسته تا زمان آزمایش (که باید همان روز باشد) نگهداری کنید.

آماده کردن نمونه
در یک ارلن g۱٠ پنیر خرد شده یا رنده شده را با دقت mg۵ توزین کنید. ml۵٠ آب مقطر بیافزایید تا هر چه ممکن است نمونه پنیر بهتر متلاشی گردد. به کمک یک اسپاتول چربی تجمع شده در سطح نمونه را بردارید. سپس به کمک دو محلول بافر استاندارد با pH های متفاوت، pH متر را تنظیم کنید (دما را در نظر داشته باشید). pH نمونه پنیر را ضمن همزدن آن اندازه گیری کنید. پس از هر اندازه گیری الکترود را با آب مقطر بشویید. در آزمایشهایی که به صورت سری صورت می گیرد، پس از هر ۴ یا ۵ اندازه گیری الکترود را با «مواد تمیز کننده [2]» تمیز کرده و سپس با آب مقطر بشویید و با کاغذ صافی آنرا خشک کنید.

روش سنجش کره یا مارگارین
آماده کردن نمونه
- مقداری در حدود g۱۱٣ از کره یا مارگارین را در یک بشر ۴٠٠ میلی لیتری قرار داده و در بن ماری در دمای بین ºC52-46 ذوب نمایید. به این ترتیب پس از مدتی (حدود ۴۵ دقیقه) چربی ذوب شده و سرم در ته بشر قرار می گیرد.
- نمونه را در هنگام گرم کردن نباید هم زد.
وقتی سرم از بخش چربی کاملا جدا شد، با پیپت سرم را برداشت کرده و آنرا به یک لوله آزمایش ۲٠٠x۲٠ منتقل نمایید. لوله محتوی سرم را بوسیله سانتریفوژ ژربر به مدت ٣ دقیقه سانتریفوژ نمایید.
- لوله حاوی سرم را به مدت ۲ ساعت در یخچال قرار دهید، تا تمام چربی که در سطح قرار گرفته به حالت جامد در آید. وقتی چربی به صورت ورقه سختی در سطح سرم تشکیل گردید، با عبور دادن یک پیپت با حجم مناسب از بخش چرب مذکور سرم را تا آنجاییکه امکان دارد برداشته و آنرا به یک بشر ٣٠ میلی لیتری منتقل نمایید. سپس سرم را تا ºC۲۵ گرم کرده و pH آنرا اندازه گیری نمایید.
- روش اندازه گیری pH، الکترود را مستقیما در داخل سرم که از کره یا مارگارین استخراج کرده اید فرو ببرید.

تعیین مقدار ازت تام شیر به روش کلدال [3]
نکته
۱- این استاندارد فقط در مورد شیرهای معمولی قابل اجرا می باشد.
۲- چنانچه مقدار پروتئین های شیر بر اساس ازت تام شیر محاسبه شود، فاکتور مورد استفاده باید ذکر شود.

نمونه برداری
مقدار معینی از شیر را وزن کرده، در مجاورت کاتالیزور اکسید جیوه و به کمک اسید سولفوریک ازت آلی را به ازت آمونیاک تبدیل می کنند، سپس آمونیاک را با اضافه کردن سود سوزآور آزاد کرده و پس از تقطیر در محلول اسید بوریک جمع آوری کرده و آمونیاک را نیتره می کنند.

مواد شیمیایی مورد نیاز
- سولفات پتاسیم
- اکسید قرمز جیوه
- اسید سولفوریک غلیظ (با وزن مخصوص ۸۴/۲ در ºC۲٠)
- محلول سود سوزآور (g۵٠٠ سود سوزآور و g۱۲ سولفورسدیم (Na25.9 H2O) را در ml۱٠٠٠ آب مقطر حل کنید)
- محلول اسید بوریک (g۴٠ اسید بوریک را در ml۱٠٠٠ آب مقطر حل کنید)
- اسید کلریدریک N1/0
- شناساگر (g۲ روژدومتیل و یک گرم بلودومتیلن را در ml۱٠٠٠ الکل اتیلیک ٩۶ درصد حل کنید)
- محلول تترا بورات دوسدیم برای تیتر کردن اسید کلریدریک

نکته
مواد شیمیایی مورد استفاده نباید حاوی ازت باشند.

تجهیزات مورد نیاز
- ترازوی آزمایشگاهی با حساسیت یک میلی گرم
- دستگاه هضم کلدال، این دستگاه باید طوری نصب شده باشد که بالن کلدال را در وضع مایل نگهدارد تا حرارت فقط به قسمتی از بالن که حاوی مایع است برسد و از این سطح تجاوز نکند
- بالن کلدال ۵٠٠ میلی لیتری
- دستگاه سرد کن Lielig با لوله داخلی مستقیم
- یک لوله انتهایی دارای یک حباب اطمینان که به قسمت تحتانی مبرد بوسیله یک لوله لاستیکی اتصال یافته است، بطوریکه شیشه در مقابل شیشه قرار گیرد
- یک لوله حبابدار ارتباطی بین بالن کلدال و سرد کن که بوسیله چوب پنبه های لاستیکی نرم اتصال یافته است
- استوانه مدرج ۲۵، ۵٠، ۱٠٠ و ۱۵٠ میلی لیتری
- بورت ۵٠ میلی لیتری با تقسیمات 1/0
- اجسامی که موجب تسهیل عمل جوش می گردند
- قطعات کوچک چینی سخت یا گلوله های شیشه ای (که در مورد عمل هضم مورد استفاده قرار می گیرند)
- قطعات کوچک سنگ پا (برای تقطیر)

روش کار
قبل از شروع آزمون درجه حرارت نمونه شیر آزمودنی را به ۲±۲٠ درجه سانتیگراد برسانید و به دقت هم بزنید. در صورتیکه چربی در تمام نمونه بطور یکنواخت در نیاید، نمونه را به ملایمت تا ºC۴٠ حرارت داده و به آهستگی به هم بزنید و تا سرد کنید.

اندازه گیری
در بالن کلدال به ترتیب چند گلوله شیشه ای یا قطعات کوچک چینی و در حدود g۱٠ سولفات پتاسیم و g۵/٠ اکسید جیوه و g۵ شیر که با دقت یک میلی گرم وزن کرده اید بریزید. سپس ml۲٠ اسید سولفوریک به آن اضافه کرده و محتوی بالن را هم بزنید. بالن کلدال را به دقت با حرارت ملایم روی دستگاه هضم حرارت دهید تا اینکه دیگر کف تولید نگردیده و محتوی بالن به صورت مایه در آید. سپس عمل هضم را با حرارت بیشتر ادامه دهید تا اینکه محتوی بالن کاملا زلال و بی رنگ شود، ضمنا در حین حرارت دادن، گاه به گاه محتوی بالن را تکان دهید.
وقتی مایع درون بالن کاملا زلال و شفاف گردید، عمل جوش را مدت ۵/۱ ساعت ادامه دهید (باید از حرارت دادن اضافی خودداری شود). سپس محتوی بالن را در حرارت محیط سرد کرده و ml۱۵٠ آب مقطر و چند قطعه سنگ پا اضافه کرده، به دقت هم بزنید و مجددا بگذارید سرد شود. آنگاه با یک استوانه مدرج ml۵٠ اسید بوریک در ارلن مایر ریخته و چهار قطره شناساگر به آن اضافه کرده و هم بزنید. ارلن مایر را از زیر سرد کن طوری قرار دهید که لوله انتهایی در محلول اسید بوریک فرو رود. سپس با یک استوانه مدرج ۸٠ میلی لیتری محلول سود سوزآور به محتوی بالن کلدال اضافه کنید و در حین این عمل بالن را به طور مورب نگهدارید، بطوریکه محلول سود در جدار ظرف جریان یافته و محلول ها با هم مخلوط نگردند. بالن کلدال را فورا بوسیله لوله اتصال حبابدار به مبرد وصل کنید. محتوی بالن را با تکان دادن هم بزنید و تا نقطه جوش حرارت دهید و در عین حال از ایجاد کف جلوگیری کنید. عمل تقطیر را ادامه دهید تا وقتی که محتوی مایع شروع به غلیان کند. حرارت را طوری تنظیم کنید که تقطیر کمینه ۲٠ دقیقه به طول انجامد. مایع تقطیر را کاملا سرد کنید تا از گرم شدن محلول اسید بوریک جلوگیری شود.
توصیه می شود که ارلن مایر حاوی اسید بوریک را در ظرف یخ نگهداشته تا از تصعید بورات آمونیوم جلوگیری شود. کمی قبل از پایان عمل تقطیر ارلن مایر را پایین آورید تا اینکه لوله انتهایی سرد کن با محلول داخل ارلن مایر در تماس نباشد. آنگاه حرارت را متوقف ساخته، لوله انتهایی سرد کن را برداشته، جدارهای داخلی و خارجی آنرا با کمی آب مقطر بشویید. مایع تقطیر را با اسید کلریدریک N1/0 تیتر کنید.

آزمون شاهد
یک آزمون شاهد را مطابق روش فوق با ml۵ آب مقطر به جای شیر انجام دهید.

محاسبه
درصد مقدار ازت تام شیر به کمک فرمول زیر محاسبه می شود :
1/40 x N( V1-V2) / p = درصد ازت تام
که در آن :
N= نرمالیته اسید کلریدریک
V1 = مقدار اسید کلریدریک مصرف شده برای نمونه (بر حسب میلی لیتر)
V0 = مقدار اسید کلریدریک مصرف شده برای شاهد (بر حسب میلی لیتر)
P = وزن شیر آزمودنی

نکته
اختلاف در عمل بین دو آزمون متوالی نباید از ٠٠۵/٠ درصد ازت تجاوز کند.

تعیین فعالیت آنزیم فسفاتاز [4] در شیر، شیر خشک، دوغ کره [5]، پودر دوغ کره [6]، لاکتوسرم [7] و پودر لاکتوسرم [8] (روش مرجع)

هدف
هدف از تدوین این استاندارد ارائه یک روش مرجع برای تعیین فعالیت آنزیم فسفاتاز در شیر، شیر خشک، دوغ کره، پودر دوغ کره، لاکتوسرم و پودر لاکتوسرم می باشد. این روش برای کنترل پاستوریزاسیون به کار می رود.

تعریف فعالیت آنزیم فسفاتاز
فعالیت آنزیم فسفاتاز یک محصول عبارت از اندازه گیری مقدار آنزیم فسفاتاز قلیایی فعال موجود در آن محصول می باشد که به وسیله مقدار فنول آزاد شده بر حسب میکروگرم در میلی لیتر نمونه یا در مورد فرآورده هایی که به شکل پودر هستند در میلی لیتر نمونه به حالت Reconstitute بیان می گردد.

اساس روش
نمونه مایع یا نمونه ای که به حالت Reconstitute در آمده است با یک محلول تامپون با ۶/۱٠pH= رقیق شده و مدت یک ساعت در گرمخانه ºC٣٧ نگهداری می شود. چنانچه احتمالا در نمونه آنزیم فسفاتاز قلیایی موجود باشد، از فنیل فسفات دی سدیم [9] اضافه شده فنول آزاد می نماید. فنول آزاد شده بعد از واکنش با ایمیدوکنیون [10] بوسیله یک روش فتومتریک اندازه گیری می شود.

معرفها
برای تهیه معرفها از آب مقطری که تازه جوشیده باشد (عاری از گازکربنیک) استفاده کنید.
- تامپون بورات و هیدروکسید باریم
g25 هیدروکسید باریم BaOH,OH2O (عاری از کربنات) را در آب حل کرده و به ml۵٠٠ برسانید. هر یک از دو محلول را در حرارت ºC۵٠ گرم کرده، آنها را هم بزنید و تکان دهید و به سرعت تا ºC۲٠ سرد کنید و در صورت لزوم pH را به کمک محلول هیدروکسید باریم در۱/٠±۶/۱٠ تثبیت کرده و صاف کنید، محلول را در ظرفی که کاملا مسدود شود نگهداری کنید. قبل از استعمال محلول را با یک حجم مساوی آب رقیق کنید.

- تامپون مخصوص ظهور رنگ
g6 متابورات سدیم (Bo2Na) یا g۶/۱۲ Bo2Na, 4H2O و g۲٠ کلرورسدیم (ClNa) را در آب حل کرده و حجم محلول را به ml۱٠٠٠ برسانید.

- ماده تامپونه [11]
g5/0 فنیل فسفات دی سدیک 2H2O, Po4C6H5Na2 را در ml۵/۴ تامپون حل کرده، دو قطره از محلول B.Q.C به آن اضافه کنید و مدت ٣٠ دقیقه در حرارت محیط بگذارید بماند. رنگی را که به این ترتیب تشکیل می شود با کمک ml۵/۲Butanol-1 استخراج نموده و تا جداشدن بوتانول بگذارید بماند در صورت لزوم عمل استخراج رنگ را تکرار کنید. محلول را می توان چند روز در یخچال نگهداری نمود. رنگ را ایجاد نموده و قبل از استعمال، دوباره آنرا استخراج نمایید. بلافاصله قبل از استعمال برای بدست آوردن ماده تامپونه یک میلی لیتر از این محلول را به کمک محلول تامپونه بورات و هیدروکسید باریم تا ml۱٠٠ رقیق کنید.
- رسوب دهنده [12] مس، روی
g3 سولفات روی 7H2O,So4Zn و g۶/٠ سولفات مس So4cu,5H2O را در آب حل کرده و حجم محلول را به ml۱٠٠ برسانید.

- محلول B.Q.C [13] یا معرف Gibb
mg1±۴٠ پودر B.Q.C، دی برموکینون کلریمید Q=C6H2Br2=NC1 را در ml۱٠ الکل اتیلیک ٩۶ درصد حل کنید و در داخل شیشه ای به رنگ تیره در یخچال نگهداری نمایید. چنانچه محلول تغییر رنگ داده باشد یا بیشتر از یک ماه مانده باشد، آنرا دور بریزید.

- تامپون مخصوص رقیق کردن رنگ
ml10 تامپون مخصوص ظهور رنگ را با آب رقیق کرده و حجم آنرا به ml۱٠٠ برسانید.

- محلول سولفات مس
- g٠۵/٠ سولفات مس (SO4CU,5H2O) را در آب حل کرده و حجم محلول را به ml۱٠٠ برسانید.

- محلول N۵/٠ هیدرات سدیم.

- محلول های استاندارد فنول
mg2±۲٠٠ فنول خالص انیدر را وزن کرده و به داخل بالن مدرج ۱٠٠ میلی لیتری منتقل نمایید و تا خط نشانه پر از آب کرده هم بزنید (این محلول در چندین ماه در یخچال پایدار باقی می ماند). ml۱٠ از این محلول را با آب رقیق کرده و حجم آنرا به ml۱٠٠ برسانید و هم بزنید (یک میلی لیتر از این محلول حاوی ۲٠٠ موگرم فنول می باشد). از این محلول برای تهیه محلول های استاندارد مخصوص حاوی ۲، ۵، ۱٠ و۲٠ موگرم فنول در هر میلی لیتر استفاده نمایید.

وسایل لازم
- ترازوی حساس
- حمام آب (بن ماری) ۱±٣٧ درجه سانتیگراد مجهز به ترموستات
- فوتومتری که بتوان با آن طول موج ۶۱٠ قرائت نمود
- لوله های آزمایش ۱۶ یا ml۱۵٠x۱۸ میلی لیتر بهتر است لوله ها تا ۵ و ml۱٠ مدرج باشد
- پیپت های ۱، ٣، ۵ و ۱٠ میلی لیتر، پیپت یک میلی لیتری باید به ml۱/٠ و پیپت ۱٠ میلی لیتری به یک میلی لیتر مدرج باشد
- قیف های شیشه ای به اندازه های مناسب مثلا به قطر 5 سانتیمتر
- کاغذ صافی cm٩ Whatman شماره S ۴۲ و S ۵٩٧ یا معادل آن
- بالن مدرج برای تهیه محلول های استاندارد
- کاغذ تورنسل

نکته
۱- تمام لوله های آزمایش و وسایل شیشه ای، چوب پنبه ها و وسایل نمونه برداری باید به دقت تمیز شده باشند. توصیه می شود که کلیه وسایل با آب مقطر که تازه جوشیده باشد شسته و در مقابل بخار گرفته شوند.
۲- بعضی از انواع درهای پلاستیکی ممکن است فنول در عمل داخل نمایند، بنابراین باید از استعمال آنها خودداری شود.

نموه برداری
طبق استاندارد ایران به شماره ٣۲۶ (سال ۱٣۵٣- روشهای نمونه برداری شیر و فرآورده های آن) قسمت مربوط به آزمون از نقطه نظر باکتریولوژیکی انجام می گیرد.

روش عمل
آماده کردن نمونه ها برای آزمون (شیر، دوغ کره و لاکتوسرم) :
- بهتر است آزمون مستقیما پس از نمونه برداری انجام شود، در غیر اینصورت نمونه را در یخچال نگهداری نمایید، ولی زمان نگهداری نباید از ۲ روز تجاوز کند.
- نمونه را به دقت هم بزنید و در صورت لزوم آنرا به ملایمت حرارت دهید، ولی درجه حرارت نباید به همین عنوان از ºC٣۵ تجاوز نماید.

خنثی کردن فرآورده های ترش
به نمونه ای از محصول ترش کمی محلول هیدرات سدیم اضافه کنید تا اینکه قطره ای از آن با کاغذ تورنسل واکنش خنثی تولید نماید.

تعیین فعالیت آنزیم فسفاتاز
نکته
- در هنگام تعیین فعالیت آنزیم فسفاتاز از تأثیر تابش مستقیم نور خورشید جلوگیری کنید.
- ذرات بزاق یا اخلاط ممکن است اشتباها نتایج مثبت دهد و بنابراین باید در هنگام برداشت با پیپت دقت کامل نمود و از این کار جلوگیری کرد.

توضیح
- در هر یک از دو لوله آزمایش یک میلی لیتر از نمونه یا نمونه Reconstitute را با پیپت داخل نمایید و یکی از دو لوله را به عنوان شاهد مشخص نمایید.
- لوله شاهد را مدت دو دقیقه در آب جوش حرارت دهید. لوله و بشر حاوی آب جوش را با یک ورقه آلومینیومی بپوشانید تا اینکه اطمینان حاصل شود که تمام لوله حرارت لازم را خواهد دید. سپس تا حرارت محیط سرد کنید.
- آنگاه لوله شاهد و لوله آزمون اصلی را به طور یکسان آزمایش کنید. ۱٠ میلی لیتر از ماده تامپونه را به داخل آن ریخته و هم بزنید.
- سپس بلافاصله مدت ۶٠ دقیقه در حمام آب (بن ماری) در دمای ºC٣٧ نگهداری کنید.
- به همان ترتیب که در قسمت فوق ذکر گردید، دو دقیقه در آب جوش حرارت دهید و در آب سرد تا حرارت محیط سرد کنید.
- در هر یک از لوله ها یک میلی لیتر از رسوب دهنده مس و روی اضافه کرده و به دقت هم بزنید.
- روی کاغذ صافی خشک صاف کنید. قطرات اول را دور ریخته و برای بار دوم در صورت لزوم صاف نمایید تا اینکه مایع صاف شده زلال و شفاف شود. حال از آن ۵ میلی لیتر در یک لوله آزمایش برداشت نمایید.
- ۵ میلی لیتر از تامپون مخصوص ظهور رنگ اضافه نمایید.
- ml۱٠/۱ از محلول B.Q.C اضافه کرده و هم بزنید و بگذارید مدت ٣٠ دقیقه در حرارت محیط مانده و رنگ تشکیل شود.
- شدت نور [14] نمونه را نسبت به لوله شاهد در طول موج n.m۶۱٠ اندازه گیری نمایید. اگر شدت نور، از شدت نور محلول استاندارد (حاوی ۲٠ موگرم فنول در لوله) بیشتر یاشد، آزمون را با یک رقت مخصوص نمونه یا نمونه Reconstitute تکرار کنید. برای تهیه این رقت یک حجم نمونه یا نمونه Reconstitute را با یک حجم معینی از یک قسمت از همان نمونه یا نمونه Reconstitute که برای بی اثر شدن فسفاتاز با احتیاط به حرارت جوش برده شده است رقیق کنید.

تهیه منحنی استاندارد
با وارد کردن یک میلی لیتر آب یک میلی لیتر از ۴ محلول استاندارد فنول در داخل هر یک از 5 لوله آزمایش یک سری محلول استاندارد حاوی صفر (شاهد) ۲، ۵، ۱٠ و ۲٠ موگرم فنول در هر لوله تهیه نمایید. به هر یک از لوله ها یک میلی لیتر از محلول سولفات مس، ۵ میلی لیتر از تامپون رنگ رقیق شده، ml٣ آب و ml۱/٠ از محلول B.Q.C اضافه کرده و هم بزنید. سپس در حرارت محیط به مدت ٣٠ دقیقه آنرا نگهداری کنید تا رنگ تشکیل شود.
آنگاه شدت نور محلول های استاندارد را نسبت به شاهد در طول موج n.m ۶۱٠ اندازه گیری نمایید.

1-2-9. اندازه گیری نقطه انجماد شیر
به طور کلی، مواد حل شده در شیر (لاکتوز، نمک های محلول و غیره) نقطه انجماد را کاهش می دهند. دستگاهی که جهت تعیین نقطه انجماد شیر مورد استفاده قرار می گیرد «هورتوت [15]» نام دارد.
هورتوت با استفاده از دماسنج های شیشه ای جیوه ای بر روی نقطه انجماد بررسی های اولیه را انجام داده است. اما آزمایشات نشان داده است که اندازه گیری های هورتوت دقیق نمی باشد.
به طور کلی در اندازه گیری نقطه انجماد شیر باید به موارد زیر باید توجه شود :
۱- زمانی که کاهش نقطه انجماد بیشتر از ºH۵۳۵⁄٠- باشد، شیر عاری از آب اضافی فرض می شود ؛
۲- وقتی که نقطه انجماد بین ۵۳٠⁄٠- و ºH۵۳۴⁄٠- باشد، به تولید کننده توصیه می گردد تا دامداری خود را کنترل نماید ؛
۳- وقتی که نقطه انجماد بین ۵۲۵⁄٠- تا ºH۵۲٩⁄٠- باشد، به احتمال زیاد آب اضافی وجود دارد ؛
۴- وقتی کاهش نقطه انجمادºH ۵۲۵⁄٠- و کمتر از آن باشد، اضافه کردن آب حتمی است(22).

طرز تهیه محیط کشت

Plate Count Ager  Mpgl Himedia   13-1. محیط کشت
13-1-1. روش تهيه محيط
برای تهيه اين محيط ۵⁄۲۳ گرم از محيط را به  همراه ۱ گرم شير خشک در ۱٠٠٠ میلی لیترآب مقطر توسط حرارت به خوبی حل کرده، سپس محيط را در شيشه های مک کارتی تقسيم کرده و دراتو کلاو در دمای ºC۱۲۱ به مدت ۱۵ دقيقه سترون می کنيم و تا زمان استفاده در يخچال نگهداری می کنيم.

13-1-2. روش کار
نمونه مورد نظر اگر شير خام باشد توسط ۵ سرم فيزيولوژی آن را رقيق می کنيم.ابتدا۱ سی سی از شير خام را توسط پیپت سترون شده وارد اولين سرم فيزيولوژی کرده، پس از مخلوط کردن،۱ سی سی از اين محيط رقيق شده را توسط پیپت سترون ديگر در سرم فيزيولوژی بعدی می ريزيم و اين عمل را ۵ بار  تکرار می کنیم و هر بار پیپت راعوض می کنيم. در آخر از آخرين سرم فيزيولوژی ۱ سی سی برداشته و داخل پليت استريل می ريزيم، سپس محيط را در مجاورت شعله روی نمونه رقيق شده می ريزيم تا محيط ببندد، سپس روی پليت را با شعله استريل می کنيم و پليت را به مدت ۴٨ ساعت  به صورت وارونه درون انکوباتور ºC۳٧ قرار می دهيم. برای خواندن پليت را روی کلنی کانت قرار داده و تعداد پرگنه ها را می خوانيم هر تعداد که خوانده شد ضربدر رقت آن می کنيم. اگر ۵ مرحله رقيق کرده باشيم ضربدر ۱٠ به توان ۵ می کنيم.
* تمام اين عملياتها بايد در حضور شعله صورت گيرد.

13-2. محیط کشت  VRB-Agr Art : 0 1406 MERCK
13-2-1. روش تهيه محيط
برای تهيه اين محيط ۵⁄۳۹ گرم از محيط را در ۱٠٠٠ سی سی آب مقطر حل کرده، سپس درب بندی کرده، در حمام آب جوش به مدت ۳٠ دقيقه قرار می دهيم تا محيط خوب حل شود، سپس محيط مهیا شده را در بن ماری ºC۴۵  قرار داده تا هنگام کار از آن استفاده کنيم.
13-2-2. روش کار
نمونه مورد نظر اگر شير پاستوريزه، شير کاکائو يا دوغ باشد۱ سی سی از نمونه را داخل پليت استريل ريخته، سپس يک لايه از محيط VRB را روی آن می ريزيم. شعله را روی آن می گيريم تا آلودگی سطحی از بين برود. اگر نمونه مورد نظر خامه، ماست يا ماست چکيده باشد، ابتدا ۱ سی سی از آن را وارد سرم فيزيولوژی کرده تا رقت ۱٠⁄۱ به دست آيد، سپس از اين رقت ۱ سی سی برداشته و سایر موارد را انجام می دهيم. پليت آماده شده را در انکوباتور ºC۳٧ به مدت ۲۴ ساعت به صورت وارونه قرار می دهيم.  بعد از گذشت اين مدت اگر دانه های قرمز رنگ نمايان شد نشانه وجود کلی فرم می باشد و در غیر اینصورت، جواب منفی می باشد.

Baird– Parker Ager Base 13-3. محیط کشت
13-3-1. روش تهيه محيط
برای تهيه اين محيط ۶٠ گرم از پودر را در ۹۵٠ سی سی آب مقطر توسط حرارت حل کرده، سپس ارلن را درب پوشی کرده و در اتوکلاو ºC۱۲۱ به مدت ۱۵ دقيقه سترون می کنيم. پس از خنک شدن۵٠ سی سی از سوسپانسيون زرده تخم مرغ Nacl و تلوريت پتاسيم را به آن اضافه کرده خوب هم می زنيم.  سپس اين محيط را در پليت های سترون شده تقسيم بندی کرده و تا زمان مصرف به صورت وارونه در يخچال  نگهداری می کنيم. برای تهيه ۵٠ سی سی سوسپانسيون زرده تخم مرغ NacL و تلوريت پتاسيم از ۲۵ سی سی زرده تخم مرغ، ۲⁄٠ گرم Nacl و ۱⁄٠ گرم تلوريت پتاسيم استفاده می کنيم.

13-3-2. روش کار
نمونه مورد نظر را توسط لوپ به صورت خطی بر روی محيط آماده می کشيم، سپس در انکوباتور ºC ۳٧ به مدت ۲۴ ساعت قرار می دهيم. بعد از گذشت این مدت اگر دانه های سياه رنگ براق همراه با هاله سفيد رنگ در آن دیده شد، نشانه وجود استافیلوکوکوس اورئوس می باشد و در غیر اینصورت نتيجه آزمايش منفی می باشد.

Chromagar- ECC Ref : Ef322 LOT : 732-c  13-4. محیط کشت
13-4-1. روش تهيه محيط
برای تهيه اين محیط ٨⁄۳۲ گرم از محيط را در۱٠٠٠ سی سی آب مقطر (پس از درب بندی حمام آب جوش) خوب حل می کنيم، سپس محيط آماده را در بن ماری ºC۴۵ قرار داده تا در مواقع لزوم از آن استفاده کنيم.

13-4-2. روش کار
نمونه مورد نظر اگر شير پاستوريزه، شير کاکائو يا دوغ باشد،‌ یک سی سی از نمونه را داخل پليت استريل ريخته، سپس يک لايه از محيط ECC را روی آن می ريزيم تا ببندد. شعله را روی آن گرفته تا آلودگی های سطحی از بين برود. اگر نمونه مورد نظر خامه، ‌ماست يا ماست چکيده باشد یک گرم از آنرا برداشته و داخل سرم فيزيولوژی می ريزيم تا رقت ۱٠⁄۱ به دست آيد. آنگاه از اين رقت یک سی سی را برداشته و سایر موارد را انجام می دهيم.  پليت آماده شده را در انکوباتور ºC ۳٧ به مدت ۲۴ ساعت به صورت وارونه قرار می دهيم. پس از گذشت این مدت اگر دانه های آبی در آن مشاهده شد نشانه وجود ایکلای است و در غیر اینصورت جواب منفی می باشد.

YGA-AgarArt = 1.1600 Merck13-5. محیط کشت
13-5-1. روش تهيه محيط
برای تهيه، اين محيط را در۱٠٠٠ سی سی آب مقطر توسط حرارت حل  کرده، سپس  در ارلن های کوچک تقسيم بندی کرده و پس از درب بندی در اتوکلا و ºC۱۲۱ به مدت ۱۵ دقیقه سترون می کنيم. بعد از انجام این مرحله، آنرا در يخچال نگهداری می کنيم. پس از آن هنگام صرف، ارلن مورد نظر را در بن ماری ºC60-50 گذاشته تا ذوب شود و سپس دمای بن ماری را روی ºC۴۵ قرار می دهيم  تا دمای محيط متعادل شود.

13-5-2. روش کار
یک سی سی از نمونه دوغ را داخل پليت استريل ريخته، سپس يک لايه از محيط آماده شده YGC را روی آن می ريزيم و می گذاريم تا ببندد. بعد آن را به صورت وارونه در انکوباتور ºC۲۵ به مدت ٧۲ ساعت قرار می دهيم آنگاه اگر دانه های سفيد رنگ در داخل آن ظاهر شد نشانه کپک و مخمر می باشد و گرنه جواب منفی می باشد.
برای تعيين تعداد مخمر ماست ابتدا ماست را به رقت 10⁄1 می رسانيم، سپس یک سی سی از نمونه را در پليت استريل ريخته و بر روی آن محيط YGC می ريزيم تا ببندد. بعد به مدت٧۲ ساعت در انکوباتور ºC۲۵ قرار می دهيم. مشاهده دانه های پرزدار بر روی سطح محيط نشاندهنده وجود کپک در ماست می باشد. مخمرها نیز به صورت دانه های ريز بدون پرز در عمق رشد می کنند.

13-6. محیط کشت لاکتوز براس Loctose Broth Art : 1.07001
13-6-1. روش تهيه محيط
برای تهيه اين محيط می توانیم از دو نوع غلظت ساده و مضاعف استفاده کنيم.
۱- برای تهيه غلظت ساده ابتدا بايد g۱۳ محيط را در۱٠٠٠ سی سی آب مقطر حل کرده، سپس در لوله های در پيچ دار حاوی لوله درهام به مقدار ۱٠ سی سی و در اتوکلاو آنرا استريل می کنيم.
۲- برای تهيه غلظت مضاعف g۲۶ از محيط را در ۱٠٠٠ گرم آب مقطر حل کرده و در لوله ای در پيچ دار حاوی لوله درهام به مقدار ۱٠ سی سی و در اتوکلاو آنرا استريل می کنيم و پس از آماده شدن آنرا در يخچال نگهداری می کنيم.

13-6-2. روش کار
۹ لوله آماده شده، شامل ۶ لوله ساده و ۳ لوله مضاعف را برداشته در ۳ لوله مضاعف در حضور شعله ۱٠ سی سی از آب را در هر کدام از لوله ها ريخته و درب آن را می بنديم. در ۳ لوله ساده اول در هر کدام یک سی سی از آب را ريخته و در ۳ لوله آخر در هر کدام ۱⁄٠ سی سی از آب را می ريزيم و به مدت ۴٨ ساعت آنرا در دمای ºC۴۴ قرار می دهيم. در صورت وجود حباب در لوله های درهام پس از طی اين زمان عدد مورد نظر خوانده می شود و از روی جدول مقدار کلی موجود در آب مشخص می شود.